Team:GO Paris-Saclay/Results

Results

Résultats

Результаты

Cas13a and Cas14a1 purification


FIGURE 1 : Coomassie staining results after nickel purification of Cas13a and Cas14a1 proteins. The bluer a sample is, the more important the protein concentration is. El : elution

Following the purification of our protein samples on nickel columns, it seems that our two proteins were efficiently purified (following a single elution for Cas13a1 and two for Cas14a1). An SDS-Page was however necessary to confirm that the eluted proteins were indeed our proteins of interest.


FIGURE 2 : Coomassie blue-stained SDS-PAGE gel with nickel-column purified SUMO-Cas13a digested with the SenP2 protease (NG13) and MBP-Cas14a1 digested with the TEV protease (NG14). Following digest, the samples were subjected to a second affinity purification on nickel column LA : ladder (sizes in kDa), NG : Non-digested, FT : Flowthrough, E : Elution (1 or 2), 13 : Cas13a , 14 : Cas14a1. Expected sizes for: SUMO-Cas13, 155 kDa; Cas13 after cleavage, 140 kDa; MBP-Cas14a1, 107 kDa; Cas14a1 after cleavage, 62 kDa.

Non-digested Cas13a measuring 155 Kda and digested Cas13a measuring 138 Kda we can conclude that Cas13a has been efficiently digested and its tags and solubilization domains removed. Concerning Cas14a1, the expected sizes before and after digestion are respectively 108 Kda and 65.5 Kda, then Cas14a1 was only partially digested. The observed fragment of about 40 Kda corresponding to the tags and solubilization domains removed. Note however that even if the tags have been removed, a part of our proteins still seems to cling to the columns.


FIGURE 3 : Heparin purification by FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) results

Following the purification on heparin column we could observe 2 absorbance peaks at 280 nm at 50 minutes for Cas13a and at 35 minutes for Cas14a1 corresponding to our two proteins of interest.


FIGURE 4 : SDS-PAGE gel corresponding to Cas14a1 after heparin purification BH : Cas14a1 before heparin purification, LA : ladder, HP : Cas14a1 after heparin purification. The 45-kDa MBP domain was eliminated thanks to the chromatography with a heparin column. We recovered the uncleaved MBP-Cas14a1 protein and the Cas14a1 protein.

The purification of cleaved Cas14a1 was controlled by SDS-Page, unfortunately, it seems that this third purification was not sufficient to purify only the cleaved protein. However, it allowed us to remove the fragments corresponding to the tags and solubilization domains.

Conclusions/Discussions :

In conclusion, we succeeded in producing and purifying Cas13a and Cas14a1 proteins, but only Cas13a could be completely cleared of its tags. For the activity tests of the proteins we finally decided to use non-digested Cas14a1.

Moreover, even if we did not detail it in the previous results, the production of Cas13a and its first purification on nickel column had to be restarted due to the unexpected tendency of the protein to aggregate at -20°C. Throughout the different purification steps, it was then kept at -4°C until heparin purification for which it had been resolubilized in a solution containing 10% of ethanol, preventing aggregation at -20°C.

Purification de Cas13a et Cas14a1


FIGURE 1 : Résultats de la coloration au bleu de Coomassie après purification des Cas13a et Cas14a1 sur colonne d’affinité au nickel Plus un échantillon est bleu plus la concentration en protéines y est importante. El : élution

Suite à la purification de nos échantillons de protéines sur colonnes de nickel, il semble que nos deux protéines aient été efficacement purifiées (suite à une seule élution pour Cas13a1 et deux pour Cas14a1). Un SDS-Page a cependant été nécessaire pour confirmer que les protéines éluées étaient bien nos protéines d'intérêt.


FIGURE 2 : Coloration de Coomassie (A) et gel de SDS-PAGE (B) correspondant à Cas13a et Cas14a1 après digestion avec la protéase SenP2 (Cas13a) ou TEV (Cas14a1) et une seconde purification sur colonne de nickel. LA : échelle, NG : Non-digérée, FT : Flowthrough, E : Elution (1 ou 2), 13 : Cas13a, 14 : Cas14a1

Cas13a non digérée mesurant 155 Kda et Cas13a digérée mesurant 138 Kda nous pouvons conclure que Cas13a a été efficacement digérée et que ses tags et domaines de solubilisation ont été enlevés. Concernant Cas14a1, les tailles attendues avant et après digestion sont respectivement de 108 Kda et 65,5 Kda, alors Cas14a1 n'a été que partiellement digéré. Le fragment observé d'environ 40 Kda correspondant aux tags et domaines de solubilisation retirés. Notons cependant que même si les tags ont été enlevés, une partie de nos protéines semble encore s'accrocher aux colonnes.


FIGURE 3 : Résultats de la purification sur héparine par FPLC

Après la purification sur colonne d'héparine, nous avons pu observer 2 pics d'absorbance à 280 nm à 50 minutes pour Cas13a et à 35 minutes pour Cas14a1 correspondant à nos deux protéines d'intérêt.


FIGURE 4 : Gel de SDS-PAGE correspondant à Cas14a1 après purification sur héparine BH : Cas14a1 avant purification sur héparine, LA : échelle, HP : Cas14a1 après purification sur héparine

La purification de Cas14a1 clivée a été contrôlée par SDS-Page, malheureusement, il semble que cette troisième purification n'ait pas été suffisante pour purifier uniquement la protéine clivée. Cependant, elle a permis d'éliminer les fragments correspondant aux tags et aux domaines de solubilisation.

Conclusions/Discussions :

En conclusion, nous avons réussi à produire et purifier les protéines Cas13a et Cas14a1, mais seule Cas13a a pu être complètement débarrassée de ses tags. Pour les tests d'activité des protéines, nous avons finalement décidé d'utiliser Cas14a1 non digérée.

Par ailleurs, même si nous ne l'avons pas détaillé dans les résultats précédents, la production de Cas13a et sa première purification sur colonne de nickel ont dû être reprises en raison de la tendance inattendue de la protéine à s'agréger à -20°C. Tout au long des différentes étapes de purification, elle a ensuite été maintenue à -4°C jusqu'à la purification à l'héparine pour laquelle elle avait été resolubilisée dans une solution contenant 10% d'éthanol, empêchant l'agrégation à -20°C.

Очистка Cas13a и Сas14a1


РИСУНОК 1: Результаты окрашивания Кумасси после очистки белков Cas13a и Cas14a1 на колонке с никелем Чем синее образец, тем важнее концентрация белка. El: элюирование

После очистки наших образцов белка на никелевых колонках оказалось, что два наших белка были эффективно очищены (после одной элюции для Cas13a1 и двух для Cas14a1). Однако SDS-Page был необходим для подтверждения того, что элюированные белки действительно были интересующими нас белками.


Рисунок 2: Окрашенный Кумасси гель SDS-PAGE с очищенным на никелевой колонке SUMO-Cas13a, расщепленным протеазой SenP2 (NG13), и MBP-Cas14a1, расщепленным протеазой TEV (NG14). После гидролиза образцы подвергали второй аффинной очистке на никелевой колонке. LA: ладдер (размеры в кДа), NG: непереваренный, FT: проточный, E: элюция (1 или 2), 13: Cas13a, 14: Cas14a1. Ожидаемые размеры для: SUMO-Cas13, 155 кДа; Cas13 после расщепления 140 кДа; MBP-Cas14a1, 107 кДа; Cas14a1 после расщепления, 62 кДа.

Мы получили нерасщепленный Cas13a размером 155 кДа и расщепленный Cas13a размером 138 кДа, мы можем сделать вывод, что Cas13a был эффективно расщеплен и что его метки и домены солюбилизации были удалены. Что касается Cas14a1, ожидаемые размеры до и после расщепления составляют соответственно 108 кДа и 65,5 кДа, поэтому Cas14a1 расщепляется только частично. Наблюдаемый фрагмент около 40 кДа соответствует удаленным меткам и доменам солюбилизации. Обратите внимание, однако, что даже если теги были удалены, некоторые из наших белков, кажется, все еще цепляются за столбцы.


РИСУНОК 3: Очистка гепарина по результатам FPLC (быстрая белковая жидкостная хроматография)

После очистки на колонке с гепарином мы смогли наблюдать 2 пика поглощения при 280 нм через 50 минут для Cas13a и через 35 минут для Cas14a1, соответствующих двум интересующим нас белкам.


Фигура 4: SDS-PAGE гель, соответствующий Cas14a1 после очистки гепарина BH: Cas14a1 до очистки гепарина, LA: ладдер, HP: Cas14a1 после очистки гепарина. Домен MBP 45 кДа был удален благодаря хроматографии на колонке с гепарином. Мы восстановили нерасщепленный белок MBP-Cas14a1 и белок Cas14a1.

Очистку расщепленного Cas14a1 контролировали с помощью SDS-Page, к сожалению, кажется, что этой третьей очистки было недостаточно для очистки только расщепленного белка. Однако это позволило удалить фрагменты, соответствующие меткам и доменам солюбилизации.

Выводы/Рассуждения :

В заключение, нам удалось получить и очистить белки Cas13a и Cas14a1, но только Cas13a удалось полностью очистить от его меток. В конце концов, для тестирования активности белков мы решили использовать нерасщепленный Cas14a1.

Более того, даже если мы не подробно описали это в предыдущих результатах, производство Cas13a и его первую очистку на никелевой колонке пришлось перезапустить из-за неожиданной тенденции белка к агрегации при -20 ° C. На протяжении различных стадий очистки его затем выдерживали при -4 ° C до очистки гепарина, для чего его повторно растворяли в растворе, содержащем 10% этанола, предотвращая агрегацию при -20 ° C.

Cas13a and Cas14a1 detection assays


FIGURE 5 : Cas13a (cr/miR-125) activity with different concentrations of crRNAs and times of pre-incubation but constant miRNA concentrations.
10 min of incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D)


FIGURE 6 : Initial velocities corresponding to the results presented on the Figure 5C.
Initial velocities (x = a.u./min).

Referring to the results presented in Figures 5 and 6, the optimal conditions for miR-125 detection with Cas13a appear to be a crRNA concentration of 5nM and a 60-minute pre-incubation (Fig 5C and 6). Indeed, although the highest fluorescent signal is observed with a 30-minutes pre-incubation (Fig 5B), the corresponding profile at the other concentrations suggests that this is a result due to measurement or handling error. On the other hand, we can see that a pre-incubation of 10 minutes or 120 minutes seems to result in a low level of fluorescence, even for the most optimal crRNA concentrations (Fig 5A and D).


FIGURE 7 : Cas13a (cr/miR-7863) only activity with different concentrations of crRNAs and times of pre-incubation but constant miRNA concentrations.
10 min of incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).


FIGURE 8 : Initiale velocities corresponding to the results presented on the Figure 7C.
Initial velocities (x = a.u./min).

The results presented in Figures 7 and 8 seem to correlate with those presented in Figures 5 and 6. As with miR-125 detection, the conditions for obtaining an optimal signal when detecting miR-7863 by Cas13a appear to be 5nM of crRNA and 60 minutes of pre-incubation (Fig 7C and 8).


FIGURE 9 : Cas13a (cr/miR-125) only reactions with different miRNA concentrations, constant crRNA concentrations (A) and associated initial velocities (B).
Initial velocities (x = a.u./min).

The results presented in Figure 9 suggest that the optimal concentration of miRNA for detection of miR-125 by Cas13a is 50 nM. The limit of detection appears to be 20nM.


FIGURE 10: Cas13a (cr/miR-125) only reactions with different bacterial RNA (A) or human RNA (B) concentrations.

By observing the results in figure 10 we can conclude that the activation of Cas13a is well specific. Indeed, Cas13 coupled to crRNA-125 does not seem to cleave the fluorophore when incubated with non-specific RNA (bacterial or human) or miR3613.


FIGURE 11 : Cas14a1 (sgRNA and ssDNA activator) only activity with different concentrations of ssDNA activator and times of pre-incubation but constant sgRNA concentrations.
10 min of incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).

Figure 11 seems to show that Cas14a1 exhibits activity even in the absence of the activator. If this activity seems to be increased a bit by its presence, it does not seem to depend on its concentration or on the pre-incubation time.


FIGURE 12 : Cascade CRISPR/Cas with different conditions and 100 nM of fluorescent ssDNA reporter (A) or 200 nM (B) for the detection of miR-125b miRNA.

Unfortunately, the cascade experiment did not seem to permit the detection of miR-125. Indeed, the fluorescence observed is probably due to the basal activity of Cas14a1 described in figure 11.

Conclusions/Discussions :

The tests shows that while the specificity of the Cas13a1 only reaction is high as we were able to detect miRNA 125 (Fig 5-7) and 7863 (Fig 8-9) without detecting non-specific RNAs (Fig 10), the sensibility needs to be improved and incubation times need to be tested over a wider range of durations to further improve the cleaving response. Unfortunately we were unable to obtain a clear detection profile of miR3613, probably due to a defect in the design of the associated crRNA.

Cas14a1 appears to have basal activity even without activation. However, this activity does not seem to increase much in the presence of an activator.

We weren't able to detect any fluorescence increase using Cas14a1 with Cas13a and ST-HP, the issue could be with the produced Cas14a1 protein itself, with its sgRNA, both ST-HP and the ssDNA activator or a combination of several of these factors.

One other hypothesis for the low activity of Cas14a1 could be a hindrance of its ability to dimerize caused by the tags that were not removed, as its dimerization seems to be an indispensable condition for its activation.

However, if the Cas14a1 protein used is really inactive due to its inability to dimerize caused by the presence of tags that we failed to remove with TEV. One possibility would be to repeat the experiments using another plasmid encoding a Cas14a1 whose tag digestion site would be recognized by another enzyme.

Tests de détection par Cas13a et Cas14a1


FIGURE 5 : Activité de Cas13a (cr/miR-125) avec différentes concentrations de crRNAs et temps de pré-incubation mais concentrations de miRNAs constantes.
10 min d'incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D)


FIGURE 6 : Vitesses initiales correspondant aux résultats présentés sur la Figure 5C.
Vitesses initiales (x = a.u./min).

En se référant aux résultats présentés dans les Figures 5 et 6, les conditions optimales pour la détection du miR-125 avec Cas13a semblent être une concentration de 5nM de crRNA et une pré-incubation de 60 minutes (Fig 5C et 6). En effet, bien que le signal fluorescent le plus élevé soit observé avec une pré-incubation de 30 minutes (Fig 5B), le profil correspondant aux autres concentrations suggère qu'il s'agit d'un résultat dû à une erreur de mesure ou de manipulation. D'autre part, on constate qu'une pré-incubation de 10 minutes ou 120 minutes semble entraîner un faible niveau de fluorescence, même pour les concentrations les plus optimales de crRNA (Fig 5A et D).


FIGURE 7 : Activité de Cas13a (cr/miR-7863) seule avec différentes concentrations de crRNAs et temps de pré-incubation mais concentrations de miRNAs constantes.
10 min d'incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).


FIGURE 8 : Vitesses initiales correspondant aux résultats présentés sur la Figure 7C.
Vitesses initiales (x = a.u./min).

Les résultats présentés dans les figures 7 et 8 semblent être en corrélation avec ceux présentés dans les figures 5 et 6. Comme pour la détection du miR-125, les conditions pour obtenir un signal optimal lors de la détection du miR-7863 par Cas13a semblent être 5nM de crRNA et 60 minutes de pré-incubation (Fig 7C et 8).


FIGURE 9 : Réactions de Cas13a (cr/miR-125) seule avec différentes concentrations de miRNA, concentrations constantes de crRNA (A) et vitesses initiales associées (B).
Vitesses initiales (x = a.u./min).

Les résultats présentés dans la figure 9 suggèrent que la concentration optimale de miRNA pour la détection du miR-125 par Cas13a est de 50 nM. La limite de détection semble être de 20 nM.


FIGURE 10 : Réactions de Cas13a (cr/miR-125) seule avec différentes concentrations d'ARN bactérien (A) ou d'ARN humain (B).

En observant les résultats de la figure 10, nous pouvons conclure que l'activation de Cas13a est bien spécifique. En effet, Cas13 couplé au crRNA-125 ne semble pas cliver le fluorophore lorsqu'il est incubé avec un ARN non spécifique (bactérien ou humain) ou miR-3613.


FIGURE 11 : Activité de Cas14a1 (sgRNA et activateur ssDNA) seule avec différentes concentrations d'activateur ssDNA et temps de pré-incubation mais concentrations constantes de sgRNA.
10 min d'incubation (A), 30 min (B), 60 min (C), 120 min (D).

La figure 11 semble montrer que Cas14a1 présente une activité même en l'absence de l'activateur. Si cette activité semble être un peu augmentée par sa présence, elle ne semble pas dépendre de sa concentration ou du temps de pré-incubation.


FIGURE 12 : Cascade CRISPR/Cas avec différentes conditions et 100 nM de rapporteur ssDNA fluorescent (A) ou 200 nM (B) pour la détection du miR-125b miRNA.

Malheureusement, l'expérience en cascade n'a pas semblé permettre la détection de miR-125. En effet, la fluorescence observée est probablement due à l'activité basale de Cas14a1 décrite en figure 11.

Conclusions/Discussions :

Les tests montrent que si la spécificité de la réaction Cas13a1 seule est élevée puisque nous avons pu détecter les miRNA 125 (Fig 5-7) et 7863 (Fig 8-9) sans détecter d'ARN non spécifiques (Fig 10), la sensibilité doit être améliorée et les temps d'incubation doivent être testés sur une plus large gamme de durées pour améliorer encore la réaction de clivage. Malheureusement, nous n'avons pas été en mesure d'obtenir un profil de détection clair du miR3613, probablement en raison d'un défaut dans la conception du crRNA associé.

Cas14a1 semble avoir une activité basale même sans activation. Cependant, cette activité ne semble pas augmenter beaucoup en présence d'un activateur.

Nous n'avons pas pu détecter d'augmentation de la fluorescence en utilisant Cas14a1 avec Cas13a et la ST-HP, le problème pourrait être lié à la protéine Cas14a1 produite elle-même, à son sgRNA, à ST-HP et à l'activateur ssDNA ou à une combinaison de plusieurs de ces facteurs.

Une autre hypothèse pour la faible activité de Cas14a1 pourrait être une entrave à sa capacité à se dimériser causée par les étiquettes qui n'ont pas été retirées, car sa dimérisation semble être une condition indispensable à son activation.

Cependant, si la protéine Cas14a1 utilisée est réellement inactive en raison de son incapacité à se dimériser causée par la présence de tags que nous n'avons pas réussi à enlever avec la TEV. Une possibilité serait de répéter les expériences en utilisant un autre plasmide codant pour une Cas14a1 dont le site de digestion des tags serait reconnu par une autre enzyme.

Тесты по детектированию Cas13a и Cas14a1


РИСУНОК 5: Активность Cas13a (cr / miR-125) при различных концентрациях crRNA и времени преинкубации, но постоянных концентрациях miRNA.
10 мин инкубации (A), 30 мин (B), 60 мин (C), 120 мин (D)


FIGURE 6 : Vitesses initiales correspondant aux résultats présentés sur la Figure 5C.
Vitesses initiales (x = a.u./min).

РИСУНОК 6: Начальные скорости, соответствующие результатам, представленным на Рисунке 5C.
Начальные скорости (x = а.е. / мин).

Ссылаясь на результаты, представленные на рисунках 5 и 6, оптимальными условиями для обнаружения miR-125 с помощью Cas13a, по-видимому, являются концентрация crРНК 5 нМ и 60-минутная преинкубация (рис. 5C и 6). Действительно, хотя самый высокий флуоресцентный сигнал наблюдается при 30-минутной предварительной инкубации (рис. 5B), соответствующий профиль при других концентрациях предполагает, что это результат может быть таким из-за ошибки измерения или обработки. С другой стороны, мы можем видеть, что предварительная инкубация в течение 10 или 120 минут, по-видимому, приводит к низкому уровню флуоресценции даже для самых оптимальных концентраций crRNA - а значит, наиболее оптимальное время инкубации будет находится в окне этих значений (рис. 5A и D).


РИСУНОК 7: Активность только Cas13a (cr / miR-7863) с разными концентрациями crRNA и временами преинкубации, но с постоянными концентрациями miRNA.
10 мин инкубации (A), 30 мин (B), 60 мин (C), 120 мин (D).


РИСУНОК 8: Начальные скорости, соответствующие результатам, представленным на Рисунке 7C.
Начальные скорости (x = а.е. / мин).

Результаты, представленные на рисунках 7 и 8, похоже, коррелируют с результатами, представленными на рисунках 5 и 6. Как и в случае обнаружения miR-125, условия для получения оптимального сигнала при обнаружении miR-7863 с помощью Cas13a, по-видимому, составляют 5 нМ crРНК и 60 минут. предварительной инкубации (рис. 7C и 8).


РИСУНОК 9: реакции только Cas13a (cr / miR-125) с разными концентрациями miRNA, постоянными концентрациями crRNA (A) и соответствующими начальными скоростями (B).
Начальные скорости (x = а.е. / мин).

Результаты, представленные на рис. 9, предполагают, что оптимальная концентрация miRNA для обнаружения miR-125 с помощью Cas13a составляет 50 нМ. Предел обнаружения составляет 20 нм.


РИСУНОК 10: Реакции только Cas13a (cr / miR-125) с различными концентрациями бактериальной РНК (A) или человеческой РНК (B).

Наблюдая за результатами на рисунке 10, мы можем сделать вывод, что активация Cas13a хорошо специфична. Действительно, Cas13, связанный с crRNA-125, по-видимому, не расщепляет флуорофор при инкубации с неспецифической РНК (бактериальной или человеческой) или miR3613.


РИСУНОК 11: Активность только Cas14a1 (активатора sgRNA и ssDNA) при различных концентрациях активатора ssDNA и времени предварительной инкубации, но постоянных концентрациях sgRNA.
10 мин инкубации (A), 30 мин (B), 60 мин (C), 120 мин (D).

Рисунок 11, по-видимому, показывает, что Cas14a1 проявляет активность даже в отсутствие активатора. Даже если эта активность немного увеличивается из-за его присутствия, это не зависит от концентрации или время предварительной инкубации.


РИСУНОК 12: Каскад CRISPR / Cas в различных условиях и 100 нМ флуоресцентного репортера оцДНК (A) или 200 нМ (B) для обнаружения miR-125b miRNA.

К сожалению, каскадный эксперимент, похоже, не позволил обнаружить miR-125. Действительно, наблюдаемая флуоресценция, вероятно, связана с базовой активностью Cas14a1, описанной на рисунке 11.

Выводы/Обсуждение :

Тесты показывают, что, хотя специфичность реакции только с Cas13a1 высока, поскольку мы смогли обнаружить miRNA 125 (Рис. 5-7) и 7863 (Рис. 8-9), не обнаруживая неспецифических РНК (Рис. 10), чувствительность необходима. необходимо улучшить, а время инкубации необходимо протестировать в более широком диапазоне продолжительности, чтобы еще больше улучшить реакцию расщепления.

К сожалению, нам не удалось получить четкий профиль обнаружения miR3613, вероятно, из-за дефекта в конструкции связанной crRNA.

Cas14a1, по-видимому, обладает базовой активностью даже без активации. Однако эта активность не сильно увеличивается в присутствии активатора.

Нам не удалось обнаружить какое-либо увеличение флуоресценции с использованием Cas14a1 с Cas13a и ST-HP, проблема могла быть в самом продуцированном белке Cas14a1 с его sgRNA, как ST-HP, так и активатором ssDNA, или в комбинации нескольких из этих факторов.

Еще одна гипотеза о низкой активности Cas14a1 может быть препятствием для его способности димеризоваться, вызванной метками, которые не были удалены, поскольку его димеризация, по-видимому, является важным условием для его активации.

Однако, если используемый белок Cas14a1 действительно неактивен из-за его неспособности димеризоваться из-за наличия меток, которые нам не удалось удалить с помощью TEV. Одна из возможностей состояла бы в том, чтобы повторить эксперименты с использованием другой плазмиды, кодирующей Cas14a1, сайт расщепления метки которого будет распознаваться другим ферментом.