Team Equipe Команда Team members Membres de l'équipe Члены команды Attributions Attributions Авторство Sponsors Sponsors Спонсоры Collaborations Collaborations Коллаборации Partnership Partnership Партнерство Project Projet Проект Description Description Описание Design Design Дизайн Results Résultats Результаты Engineering Success Engineering Success Успех в инженерии Laboratory Laboratoire Лаборатория Experiments Expériences Эксперименты Hardware Hardware Установка Parts Biobricks Части Contribution Contribution Вклад Safety Sécurité Безопасность Proof of concept Preuve du concept Подтверждение модели Notebook Cahier de laboratoire Лаб. книга Model Modèle Моделирование Software Logiciel Софт/ПО Societal outreach Ouverture sur la société Работа с обществом Integrated Human Practices Sciences Humaines Intégrées Cвязанная с проектом Science Education Sensibilisation aux sciences Просветительская деятельностьм Inclusivity Inclusion Инклюзивность Implementation Implémentation Реализация Science Communication Communication Scientifique научная коммуникация Awards Prix Награды Langues Languages Языки English Français Русский Colors Couleurs Цвет текста Tout texte All text Текст Remettre à 0 Reset Сброс настроек Assistance navigation Handsfree assistant Голосовой помощник Speech recognition Reconnaissance vocale Голосовой помощник Start speech recognition *click above to start the speech recognition assistance. Speak clearly and and say the name of a page.More informations: To escape from the flashlight animation of the home page = right click. If the animations do not start on the home page, please refresh the page. Click on the detective Coli to start the experiments. Table of contents Sequences of miRNAs and ST-HP RNAs and DNAs synthesis Cas13a and Cas14a1 purification Cas13a and Cas14a1 detection assays Materials and Methods Matériels et Méthodes Материалы и методы Sequences of miRNAs and ST-HP Two miRNAs were chosen for the significance of the difference in their expression in the serum of women with endometriosis compared to healthy women : concentration of the miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) was greatly increased in the serum of women suffering from endometriosis compared to unaffected women, while that of miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC) was reduced (Cosar et al., 2016) (Moustafa et al., 2020). The dual DNA-RNA molecule called ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGAUUCTGGGAGAATGTAACTACGCC) was synthesized by Eurofins. Séquences des miRNAs et de la ST-HP Deux ARNs ont été choisis pour l'importance de la différence de leur expression dans le sérum des femmes atteintes d'endométriose par rapport à des femmes saines : la concentration du miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) était fortement augmentée dans le sérum des femmes souffrant d'endométriose par rapport aux femmes non atteintes, tandis que celle du miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUUC) était réduite (Cosar et al, 2016) (Moustafa et al., 2020). La molécule ADN-ARN appelée ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGAUUCTGGGAGAATGTAACTACGCC) a été synthétisée par Eurofins. Последовательности микроРНК и шпилька ST-HP Две микроРНК были выбраны из-за значимости разницы в их экспрессии в сыворотке крови женщин с эндометриозом по сравнению со здоровыми женщинами: концентрация miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) была значительно увеличена в сыворотке крови женщин, страдающих эндометриозом, по сравнению с здоровыми женщинами. , тогда как miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC) была снижена (Cosar et al., 2016) (Moustafa et al., 2020). Двойная молекула ДНК-РНК под названием шпилька ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGAUUCTGGGAGAATGTAACTACGCC) была синтезирована компанией Eurofins. RNAs and DNAs synthesis Sequences of crRNAs of Cas13a or sgRNA of Cas14a1 allow the formation of a stem-loop structure. This is recognizable by the protein followed by a sequence complementary to the target miRNAs or to that of the segment released following ST-HP cleavage, respectively. Geneblock or complementary primers synthetized by IDT (Table 1) were used to generate dsDNA fragments that served as template for RNA synthesis using the T7 Ribomax express kit from Promega. RNAs were further purified with Promega ReliaPrep columns and checked by electrophoresis on urea-acrylamide gels. Reporter probes for Cas protein activity with fluorophore (FAM) and quencher (BHQ1) were ordered at Eurofins (Table 1). TABLE 1: Primers and geneblocks used in this project (T7 promoter sequence is indicated in italics). Synthèse des ARNs et ADNs Les séquences des crRNAs de Cas13a ou du sgRNA de Cas14a1 permettent la formation d'une structure tige-boucle. Celle-ci est reconnaissable par la protéine et est suivie d'une séquence complémentaire aux miRNAs cibles ou à celle du segment libéré suite au clivage de la ST-HP. Des Geneblock ou amorces complémentaires synthétisées par IDT (tableau 1) ont été utilisées pour générer des fragments d'ADNdb qui ont servi de matrice pour la synthèse d'ARN à l'aide du kit T7 Ribomax express de Promega. Les ARN ont ensuite été purifiés avec les colonnes ReliaPrep de Promega et vérifiés par électrophorèse sur des gels d'urée-acrylamide. Des sondes rapporteuses de l'activité des protéine Cas avec fluorophore (FAM) et quencher (BHQ1) ont été commandées chez Eurofins (Tableau 1). TABLEAU 1: Amorces et geneblocks utilisés durant ce projet (la séquence du promoteur T7 est indiquée en italique). Синтез РНК и ДНК Последовательности crRNA Cas13a или sgRNA Cas14a1 позволяют формировать структуру петля-стержень. Это распознается белком, за которым следует последовательность, комплементарная миРНК-мишени или последовательности сегмента, высвобождаемого после расщепления ST-HP, соответственно. Геноблок или комплементарные праймеры, синтезированные с помощью IDT (таблица 1), использовали для создания фрагментов дцДНК, которые служили в качестве матрицы для синтеза РНК с использованием экспресс-набора T7 Ribomax от Promega. РНК дополнительно очищали на колонках Promega ReliaPrep и проверяли электрофорезом на мочевинно-акриламидных гелях. Репортерные зонды активности белка Cas с флуорофором (FAM) и гасителем (BHQ1) были заказаны в Eurofins (Таблица 1). ТАБЛИЦА 1: Праймеры и генные блоки, использованные в этом проекте (последовательность промотора Т7 указана курсивом). Cas13a and Cas14a1 purification FIGURE 1 : Schema representing the purification process of the Cas13a and Cas14a1 proteins used. For the production of Cas13a and Cas14a1, E.coli Rosetta strain was transformed with plasmids pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI or pLBH531_His10-MBP-Cas14a1, respectively (Gootenberg et al., 2018; Harrington et al., 2018). The plasmids, which were ordered from Addgene, carry an ampicillin resistance gene and allow the constitutive production of the transcription inhibitor LacI. Expression of the gene of interest is under the control of the T7 polymerase (already expressed by Rosetta strain) promoter and the lacO operator. Transformed bacteria were grown overnight in LB supplemented with ampicillin (200 mg/mL), chloramphenicol (30 mg/mL) and glucose (0.2%). Cells were diluted in 1 L Terrific Broth (rich medium) supplemented with antibiotics to OD600=0.1 and grown at 37°C until the OD reached 0.5. Then, IPTG (0.5 mM) was added and the culture was shaken at 18°C for 16 h for protein production. The bacteria were harvested by centrifugation at 5000xg for 15 min and resuspended in 40 mL LEW buffer (50mM NaH2PO4 300 mM NaCl pH 8.0) containing Complete protease inhibitor cocktail (Roche). Following lysis by sonication, the proteins carrying His-tags were purified using nickel columns (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) and digested with SenP2 (Cas13a) or TEV protease (Cas14a1) in order to remove the histidine tags and solubilization domains they carried. Cas13a was then purified by FPLC on heparin column (1 mL, GE Healthcare) using a gradient using solution A (50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM beta-mercaptoethanol (BME)) and solution B (50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 1 M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME). For heparin purification of Cas14a1, solution B was 50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 1.5 M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME. Proteins were then diluted 3-fold in 50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 20 m M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME. Finally, a Millipore centrifugal device was used to concentrate the protein. Proteins were stored at -20°C after adding glycerol up to 50%. Proteins were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie staining. Purification de Cas13a et Cas14a1 FIGURE 1 : Schéma représentant le processus utilisé pour la purification des protéines Cas13a et Cas14a1. Pour la production de Cas13a et Cas14a1, la souche E.coli Rosetta a été transformée avec les plasmides pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI ou pLBH531_His10-MBP-Cas14a1, respectivement (Gootenberg et al., 2018 ; Harrington et al., 2018). Ces plasmides, commandés chez Addgene, portent un gène de résistance à l'ampicilline et permettent la production constitutive de l'inhibiteur de transcription LacI. L'expression du gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur de la polymérase T7 (déjà exprimée par la souche Rosetta) et de l'opérateur lacO. Les bactéries transformées ont été cultivées pendant une nuit dans du milieu LB complété par de l'ampicilline (200 mg/mL), du chloramphénicol (30 mg/mL) et du glucose (0,2%). Les cellules ont été diluées dans 1 L de Terrific Broth (milieu riche) complété par des antibiotiques jusqu'à une DO600=0,1 et cultivées à 37°C jusqu'à ce que la DO atteigne 0,5. Ensuite, de l'IPTG (0,5 mM) a été ajouté et la culture a été agitée à 18°C pendant 16 h pour la production de protéines. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 5000xg pendant 15 min et remises en suspension dans 40 mL de tampon LEW (50mM NaH2PO4 300 mM NaCl pH 8.0) contenant un cocktail complet d'inhibiteurs de protéase (Roche). Après lyse par sonication, les protéines portant des étiquettes His ont été purifiées à l'aide de colonnes de nickel (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) et digérées avec la protéase SenP2 (Cas13a) ou TEV (Cas14a1) afin d'éliminer les étiquettes histidine et les domaines de solubilisation qu'elles portaient. Cas13a a ensuite été purifié par FPLC sur une colonne d'héparine (1 mL, GE Healthcare) en utilisant un gradient comprenant la solution A (50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM beta-mercaptoethanol (BME)) et la solution B (50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 1 M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME). Pour la purification de Cas14a1 à l'héparine, la solution B était constituée de 50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 1,5 M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME. Les protéines ont ensuite été diluées 3 fois dans 50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 20 m M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME. Enfin, un dispositif de centrifugation Millipore a été utilisé pour concentrer les protéines. Les protéines ont été conservées à -20°C après ajout de glycérol jusqu'à 50%. Les protéines ont été analysées par SDS-PAGE et coloration de Coomassie. Очистка Cas13a и Cas14a1 РИСУНОК 1: Схема, представляющая процесс очистки используемых белков Cas13a и Cas14a1. Для продукции Cas13a и Cas14a1 штамм E.coli Rosetta трансформировали плазмидами pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI или pLBH531_His10-MBP-Cas14a1 соответственно (Gootenberg et al., 2018; Harrington et al., 2018). Плазмиды, которые были заказаны у Addgene, несут ген устойчивости к ампициллину и позволяют конститутивно продуцировать ингибитор транскрипции LacI. Экспрессия интересующего гена находится под контролем промотора полимеразы Т7 (уже экспрессируемого штаммом Rosetta) и оператора lacO. Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи в LB с добавлением ампициллина (200 мг / мл), хлорамфеникола (30 мг / мл) и глюкозы (0,2%). Клетки разводили в 1 л Terrific Broth (богатая среда) с добавлением антибиотиков до OD600 = 0,1 и выращивали при 37 ° C до достижения OD 0,5. Затем добавляли IPTG (0,5 мМ) и культуру встряхивали при 18 ° C в течение 16 часов для продукции белка. Бактерии собирали центрифугированием при 5000g в течение 15 мин и ресуспендировали в 40 мл буфера LEW (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 8,0), содержащего коктейль полного ингибитора протеазы (Roche). После лизиса ультразвуком белки, несущие His-метки, очищали с использованием никелевых колонок (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) и расщепляли с помощью SenP2 (Cas13a) или протеазы TEV (Cas14a1) для удаления гистидиновых меток и доменов солюбилизации. они несли. Затем Cas13a очищали с помощью FPLC на колонке с гепарином (1 мл, GE Healthcare), используя градиент с использованием раствора A (50 мМ NaH2PO4, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ бета-меркаптоэтанол (BME)) и раствора B (50 мМ NaH2PO4, pH 7,5, 1 M NaCl, 10% глицерин, 1 мМ BME). Для очистки Cas14a1 гепарином раствор B представлял собой 50 мМ NaH2PO4 pH 7,5, 1,5 М NaCl, 10% глицерин, 1 мМ BME. Затем белки разбавляли в 3 раза 50 мМ NaH2PO4 pH 7,5, 20 мМ NaCl, 10% глицерином, 1 мМ BME. Наконец, для концентрирования белка использовали центробежное устройство Millipore. Белки хранили при -20 ° C после добавления глицерина до 50%. Белки анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси. Cas13a and Cas14a1 detection assays All the measurements were made on 96 wells fluorescent assay plates. We first denatured our oligos at 65°C (cooling down at -2°C/min until reaching room temperature), and then incubated at 37°C, Cas13 and Cas14 with their corresponding cr/sgRNA, respectively : crRNA 125, 3613 or 7863 for Cas13 and sgRNA for Cas14. Each Cas complex was then incubated with its activator (miRNA for a Cas13 only assay or ssDNA activator for a Cas14 only assay, and activated Cas13 complex + cleaved ST-HP for a full cascade test). Incubation times of 10 minutes, 30 minutes, 1 hour and 2 hours were tested for each step to optimize the reactions. FIGURE 2 : Cas13a-only reaction Detailed process of the reaction used to test Cas13a independently from the rest of the system. We first denatured both the crRNA (from 5 to 100 nM) and the miRNA (from 0.2 to 200 nM) of our chosen couple, we then incubated the denatured crRNA with the Cas13 (20 nM) protein and incubated the now bound Cas13a/crRNA complex with the miRNA for annealing. Once this step is over we mixed the solution with a buffer and the RNA probe (200 nM) on a fluorescence assay plate. This reaction was used first to assess whether or not Cas13a alone was efficient for miRNA detection. And once the enzymatic activity was confirmed we used it with both crRNA (Fig 5-8) and miRNA (Fig 9-10) concentration gradients to find their optimal concentration for the cascade reaction. All three mi/crRNA couples were tested with the crRNA concentration gradient while only the mi/crRNA-125b couple was tested with the miRNA gradient. We also tested the Cas13 only reaction in a heterogeneous medium composed of Hela cell total RNA acquired from I2BC lab (50 to 600 nM) , we did the same with bacterial total RNA extracted from a Rosetta strain culture done previously (50 to 600 nM), using it as specificity control. FIGURE 3 : Cas14a1-only reaction Detailed process of the reaction used to test Cas14a1 independently from the rest of the system. We first denatured the sgRNA and once denatured we incubated it with Cas14 (30 nM). Once bound we incubated the Cas14a1/sgRNA complex with an ssDNA activator (6 to 120 nM) for annealing. After both these steps were completed we mixed the complexe with the ssDNA probe (500 nM) on the fluorescence assay plate. This reaction was used to assess whether or not Cas14a1 alone was efficient. We tested it with varying concentrations of sgRNA but constant concentrations of other elements (Fig 11). FIGURE 4 : Cascade reaction Detailed process of the final cascade reaction. We first denatured all three previously used elements, sgRNA and our crRNA/miRNA couple of choice. We then incubated Cas14a1 (30 nM) with the sgRNA (12 or 30 nM) and Cas13 (20 nM) with the crRNA (20 nM), afterward we incubated the Cas13/crRNA complex with the miRNA. We incubated once again now activated Cas13 (Cas13 + crRNA + miRNA) with ST-HP (200 nM). Afterward we incubated the activated Cas13 and the cleaved ST-HP with the inactive Cas14/sgRNA complex, ST-HP’s now exposed single strand would now anneal with the Cas14/sgRNA complex which would result in an active Cas14. Once all those steps are completed we mixed everything with the ssDNA probe (100, 200 or 500 nM) on a fluorescence assay plate.FIGURE 5 : All used reactions recap. Tests de détection par Cas13a et Cas14a1 Toutes les mesures ont été effectuées en plaques d’essais fluorescents 96 puits. Nous avons d'abord dénaturé nos oligos à 65°C (refroidissement à -2°C/min jusqu'à atteindre la température ambiante), puis nous avons incubé à 37°C, Cas13 et Cas14 avec leurs cr/sgRNA correspondants, respectivement : crRNA 125, 3613 ou 7863 pour Cas1a3 et sgRNA pour Cas14a1. Chaque complexe Cas a ensuite été incubé avec son activateur (miRNA pour un test Cas13 seule, activateur ssDNA pour un test Cas14 seule, et complexe Cas13 activé + ST-HP clivé pour un test en cascade complet). Des temps d'incubation de 10 minutes, 30 minutes, 1 heure et 2 heures ont été testés pour chaque étape afin d'optimiser les réactions. FIGURE 2 : Réaction avec Cas13a seule Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester Cas13a indépendamment du reste du système. Nous avons d'abord dénaturé le crRNA (5 à 100 nM) et le miRNA (0,2 à 200 nM) de notre couple choisi, puis nous avons incubé le crRNA dénaturé avec la protéine Cas13a (20 nM). Nous avons ensuite incubé le complexe Cas13/crRNA nouvellement formé avec le miRNA pour l'hybridation. Une fois cette étape terminée, nous avons mélangé la solution avec un tampon et la sonde ARN (200 nM) sur une plaque d'essai de fluorescence. Cette réaction a d'abord été utilisée pour évaluer si Cas13a était efficace pour la détection des miRNAs, et une fois l'activité enzymatique confirmée, nous l'avons utilisée avec des gradients de concentration de crRNA (Fig 5-8) et de miRNA (Fig 9-10) pour trouver leurs concentration optimale pour la réaction en cascade. Les trois couples mi/crRNA ont été testés avec le gradient de concentration crRNA tandis que seul le couple mi/crRNA-125b a été testé avec le gradient miRNA. Nous avons également testé la réaction de Cas13a seule dans un milieu hétérogène composé d'ARN total de cellules Hela acquis auprès du laboratoire I2BC (50 à 600 nM), nous avons fait de même avec de l'ARN total bactérien extrait d'une culture de la souche Rosetta réalisée précédemment (50 à 600 nM), utilisant ainsi ces deux tests comme contrôles de spécificité. FIGURE 3 : Réaction avec Cas14a1 seule Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester Cas14a1 indépendamment du reste du système. Nous avons d'abord dénaturé le sgRNA et une fois dénaturé nous l'avons incubé avec Cas14a1 (30 nM). Une fois lié nous avons incubé le complexe Cas14/sgRNA avec un activateur ssDNA (6 à 120 nM) pour hybridation. Après que ces deux étapes aient été terminées, nous avons mélangé le complexe avec la sonde d'ADNsb (500 nM) sur la plaque d'essai de fluorescence. Cette réaction a été utilisée pour évaluer si Cas14a1 seule était efficace ou non. Nous l'avons testée avec des concentrations variables de sgRNA mais des concentrations constantes des autres éléments (Fig 11). FIGURE 4 : Réaction en Cascade Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester la réaction en cascade. Nous avons d'abord dénaturé les trois éléments précédemment utilisés, le sgRNA et le couple crRNA/miRNA de notre choix. Nous avons ensuite incubé Cas14a1 (30 nM) avec le sgRNA (12 ou 30 nM) et Cas13a (20 nM) avec le sgRNA (20 nM), puis nous avons incubé le complexe Cas13a/crRNA avec le miRNA. Nous avons incubé une fois de plus Cas13a maintenant activée (Cas13a + crRNA + miRNA) avec la ST-HP (200 nM). Ensuite, nous avons incubé la Cas13a activée et la ST-HP clivée avec le complexe Cas14a1/sgRNA inactif. Le simple brin exposé de la ST-HP va maintenant s'hybrider avec le complexe Cas14a1/sgRNA, ce qui donnera une Cas14 active. Une fois toutes ces étapes terminées, nous avons mélangé le tout avec la sonde ADNsb (100, 200 ou 500 nM) sur une plaque d'essai de fluorescence. FIGURE 5 : Récapitulation de toutes les réactions utilisées. Анализы для обнаружения Cas13a и Cas14a1 Все измерения проводились на 96-луночных планшетах для флуоресцентного анализа. Сначала мы денатурировали наши олигонуклеотиды при 65 ° C (охлаждение со скоростью -2 ° C / мин до достижения комнатной температуры), а затем инкубировали при 37 ° C, Cas13 и Cas14 с их соответствующими cr / sgRNA, соответственно: crRNA 125, 3613 или 7863 для Cas13 и sgRNA для Cas14. Затем каждый комплекс Cas инкубировали с его активатором (miRNA для анализа только Cas13 или активатор ssDNA для анализа только Cas14 и активированный комплекс Cas13 + расщепленный ST-HP для полного каскадного теста). Время инкубации составляло 10 минут, 30 минут, 1 час и 2 часа для каждого шага, чтобы оптимизировать реакции. РИСУНОК 2: Реакция только Cas13a Подробный процесс реакции использовался для тестирования Cas13a независимо от остальной системы. Сначала мы денатурировали как crRNA (от 5 до 100 нМ), так и miRNA (от 0,2 до 200 нМ) выбранной нами пары, затем мы инкубировали денатурированную crRNA с белком Cas13 (20 нМ) и инкубировали теперь связанный комплекс Cas13a / crRNA с miRNA для отжига. По завершении этого этапа мы смешали раствор с буфером и зондом РНК (200 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа. Эта реакция была использована сначала, чтобы оценить, эффективен ли только Cas13a для обнаружения miRNA. И как только ферментативная активность была подтверждена, мы использовали ее с градиентами концентрации как crRNA (рис. 5-8), так и miRNA (рис. 9-10), чтобы найти их оптимальную концентрацию для каскадной реакции. Все три пары mi / crRNA тестировали с градиентом концентрации crRNA, тогда как только пару mi / crRNA-125b тестировали с градиентом miRNA. Мы также протестировали реакцию только Cas13 в гетерогенной среде, состоящей из общей РНК клеток Hela, полученной из лаборатории I2BC (от 50 до 600 нМ), мы сделали то же самое с общей РНК бактерий, экстрагированной из культуры штамма Rosetta, сделанной ранее (от 50 до 600 нМ). , используя его как контроль специфичности. РИСУНОК 3: Реакция только Cas14a1 Подробный процесс реакции, используемый для тестирования Cas14a1, независимо от остальной системы. Сначала мы денатурировали sgRNA, а после денатурирования инкубировали ее с Cas14a1 (30 нМ). После связывания мы инкубировали комплекс Cas14 / sgRNA с активатором ssDNA (от 6 до 120 нМ) для гибридизации. После завершения этих двух этапов мы смешали комплекс с зондом оцДНК (500 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа. Эту реакцию использовали для оценки эффективности только Cas14a1. Мы протестировали его с различными концентрациями sgRNA, но постоянными концентрациями других элементов (рис. 11). РИСУНОК 4: Каскадная реакция Подробный процесс финальной каскадной реакции. Сначала мы денатурировали три использованных ранее элемента, sgRNA и пару crRNA / miRNA по нашему выбору. Затем мы инкубировали Cas14a1 (30 нМ) с sgRNA (12 или 30 нМ) и Cas13a (20 нМ) с sgRNA (20 нМ). Затем мы инкубировали комплекс Cas13a / crRNA с miRNA. Мы снова инкубировали активированный Cas13a (Cas13a + crRNA + miRNA) с ST-HP (200 нМ), после инкубировали активированный Cas13a и расщепленный ST-HP с неактивным комплексом Cas14a1 / sgRNA. Обнаруженная одиночная цепь шпильки ST-HP теперь будет гибридизоваться с комплексом Cas14a1 / sgRNA, в результате чего образуется активный Cas14. После того, как все эти шаги были выполнены, мы смешали все с зондом оцДНК (100, 200 или 500 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа.РИСУНОК 5: Сводка всех использованных реакций.
Click on the detective Coli to start the experiments.
Sequences of miRNAs and ST-HP Two miRNAs were chosen for the significance of the difference in their expression in the serum of women with endometriosis compared to healthy women : concentration of the miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) was greatly increased in the serum of women suffering from endometriosis compared to unaffected women, while that of miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC) was reduced (Cosar et al., 2016) (Moustafa et al., 2020). The dual DNA-RNA molecule called ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGAUUCTGGGAGAATGTAACTACGCC) was synthesized by Eurofins.
Séquences des miRNAs et de la ST-HP Deux ARNs ont été choisis pour l'importance de la différence de leur expression dans le sérum des femmes atteintes d'endométriose par rapport à des femmes saines : la concentration du miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) était fortement augmentée dans le sérum des femmes souffrant d'endométriose par rapport aux femmes non atteintes, tandis que celle du miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUUC) était réduite (Cosar et al, 2016) (Moustafa et al., 2020). La molécule ADN-ARN appelée ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGAUUCTGGGAGAATGTAACTACGCC) a été synthétisée par Eurofins.
Последовательности микроРНК и шпилька ST-HP Две микроРНК были выбраны из-за значимости разницы в их экспрессии в сыворотке крови женщин с эндометриозом по сравнению со здоровыми женщинами: концентрация miRNA miR-125b (UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA) была значительно увеличена в сыворотке крови женщин, страдающих эндометриозом, по сравнению с здоровыми женщинами. , тогда как miR-3613 (UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC) была снижена (Cosar et al., 2016) (Moustafa et al., 2020). Двойная молекула ДНК-РНК под названием шпилька ST-HP (GGCGTAGTTACATTCTCCCAGTTGAUUCTGGGAGAATGTAACTACGCC) была синтезирована компанией Eurofins.
RNAs and DNAs synthesis Sequences of crRNAs of Cas13a or sgRNA of Cas14a1 allow the formation of a stem-loop structure. This is recognizable by the protein followed by a sequence complementary to the target miRNAs or to that of the segment released following ST-HP cleavage, respectively. Geneblock or complementary primers synthetized by IDT (Table 1) were used to generate dsDNA fragments that served as template for RNA synthesis using the T7 Ribomax express kit from Promega. RNAs were further purified with Promega ReliaPrep columns and checked by electrophoresis on urea-acrylamide gels. Reporter probes for Cas protein activity with fluorophore (FAM) and quencher (BHQ1) were ordered at Eurofins (Table 1).
TABLE 1: Primers and geneblocks used in this project (T7 promoter sequence is indicated in italics).
Synthèse des ARNs et ADNs Les séquences des crRNAs de Cas13a ou du sgRNA de Cas14a1 permettent la formation d'une structure tige-boucle. Celle-ci est reconnaissable par la protéine et est suivie d'une séquence complémentaire aux miRNAs cibles ou à celle du segment libéré suite au clivage de la ST-HP. Des Geneblock ou amorces complémentaires synthétisées par IDT (tableau 1) ont été utilisées pour générer des fragments d'ADNdb qui ont servi de matrice pour la synthèse d'ARN à l'aide du kit T7 Ribomax express de Promega. Les ARN ont ensuite été purifiés avec les colonnes ReliaPrep de Promega et vérifiés par électrophorèse sur des gels d'urée-acrylamide. Des sondes rapporteuses de l'activité des protéine Cas avec fluorophore (FAM) et quencher (BHQ1) ont été commandées chez Eurofins (Tableau 1).
TABLEAU 1: Amorces et geneblocks utilisés durant ce projet (la séquence du promoteur T7 est indiquée en italique).
Синтез РНК и ДНК Последовательности crRNA Cas13a или sgRNA Cas14a1 позволяют формировать структуру петля-стержень. Это распознается белком, за которым следует последовательность, комплементарная миРНК-мишени или последовательности сегмента, высвобождаемого после расщепления ST-HP, соответственно. Геноблок или комплементарные праймеры, синтезированные с помощью IDT (таблица 1), использовали для создания фрагментов дцДНК, которые служили в качестве матрицы для синтеза РНК с использованием экспресс-набора T7 Ribomax от Promega. РНК дополнительно очищали на колонках Promega ReliaPrep и проверяли электрофорезом на мочевинно-акриламидных гелях. Репортерные зонды активности белка Cas с флуорофором (FAM) и гасителем (BHQ1) были заказаны в Eurofins (Таблица 1).
ТАБЛИЦА 1: Праймеры и генные блоки, использованные в этом проекте (последовательность промотора Т7 указана курсивом).
Cas13a and Cas14a1 purification
FIGURE 1 : Schema representing the purification process of the Cas13a and Cas14a1 proteins used. For the production of Cas13a and Cas14a1, E.coli Rosetta strain was transformed with plasmids pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI or pLBH531_His10-MBP-Cas14a1, respectively (Gootenberg et al., 2018; Harrington et al., 2018). The plasmids, which were ordered from Addgene, carry an ampicillin resistance gene and allow the constitutive production of the transcription inhibitor LacI. Expression of the gene of interest is under the control of the T7 polymerase (already expressed by Rosetta strain) promoter and the lacO operator. Transformed bacteria were grown overnight in LB supplemented with ampicillin (200 mg/mL), chloramphenicol (30 mg/mL) and glucose (0.2%). Cells were diluted in 1 L Terrific Broth (rich medium) supplemented with antibiotics to OD600=0.1 and grown at 37°C until the OD reached 0.5. Then, IPTG (0.5 mM) was added and the culture was shaken at 18°C for 16 h for protein production. The bacteria were harvested by centrifugation at 5000xg for 15 min and resuspended in 40 mL LEW buffer (50mM NaH2PO4 300 mM NaCl pH 8.0) containing Complete protease inhibitor cocktail (Roche). Following lysis by sonication, the proteins carrying His-tags were purified using nickel columns (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) and digested with SenP2 (Cas13a) or TEV protease (Cas14a1) in order to remove the histidine tags and solubilization domains they carried. Cas13a was then purified by FPLC on heparin column (1 mL, GE Healthcare) using a gradient using solution A (50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM beta-mercaptoethanol (BME)) and solution B (50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 1 M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME). For heparin purification of Cas14a1, solution B was 50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 1.5 M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME. Proteins were then diluted 3-fold in 50 mM NaH2PO4 pH 7.5, 20 m M NaCl, 10% glycerol, 1 mM BME. Finally, a Millipore centrifugal device was used to concentrate the protein. Proteins were stored at -20°C after adding glycerol up to 50%. Proteins were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie staining.
Purification de Cas13a et Cas14a1
FIGURE 1 : Schéma représentant le processus utilisé pour la purification des protéines Cas13a et Cas14a1. Pour la production de Cas13a et Cas14a1, la souche E.coli Rosetta a été transformée avec les plasmides pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI ou pLBH531_His10-MBP-Cas14a1, respectivement (Gootenberg et al., 2018 ; Harrington et al., 2018). Ces plasmides, commandés chez Addgene, portent un gène de résistance à l'ampicilline et permettent la production constitutive de l'inhibiteur de transcription LacI. L'expression du gène d'intérêt est sous le contrôle du promoteur de la polymérase T7 (déjà exprimée par la souche Rosetta) et de l'opérateur lacO. Les bactéries transformées ont été cultivées pendant une nuit dans du milieu LB complété par de l'ampicilline (200 mg/mL), du chloramphénicol (30 mg/mL) et du glucose (0,2%). Les cellules ont été diluées dans 1 L de Terrific Broth (milieu riche) complété par des antibiotiques jusqu'à une DO600=0,1 et cultivées à 37°C jusqu'à ce que la DO atteigne 0,5. Ensuite, de l'IPTG (0,5 mM) a été ajouté et la culture a été agitée à 18°C pendant 16 h pour la production de protéines. Les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 5000xg pendant 15 min et remises en suspension dans 40 mL de tampon LEW (50mM NaH2PO4 300 mM NaCl pH 8.0) contenant un cocktail complet d'inhibiteurs de protéase (Roche). Après lyse par sonication, les protéines portant des étiquettes His ont été purifiées à l'aide de colonnes de nickel (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) et digérées avec la protéase SenP2 (Cas13a) ou TEV (Cas14a1) afin d'éliminer les étiquettes histidine et les domaines de solubilisation qu'elles portaient. Cas13a a ensuite été purifié par FPLC sur une colonne d'héparine (1 mL, GE Healthcare) en utilisant un gradient comprenant la solution A (50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM beta-mercaptoethanol (BME)) et la solution B (50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 1 M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME). Pour la purification de Cas14a1 à l'héparine, la solution B était constituée de 50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 1,5 M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME. Les protéines ont ensuite été diluées 3 fois dans 50 mM NaH2PO4 pH 7,5, 20 m M NaCl, 10% de glycérol, 1 mM BME. Enfin, un dispositif de centrifugation Millipore a été utilisé pour concentrer les protéines. Les protéines ont été conservées à -20°C après ajout de glycérol jusqu'à 50%. Les protéines ont été analysées par SDS-PAGE et coloration de Coomassie.
Очистка Cas13a и Cas14a1
РИСУНОК 1: Схема, представляющая процесс очистки используемых белков Cas13a и Cas14a1. Для продукции Cas13a и Cas14a1 штамм E.coli Rosetta трансформировали плазмидами pC0072 LbuCas13a His6-TwinStrep-SUMO-BsaI или pLBH531_His10-MBP-Cas14a1 соответственно (Gootenberg et al., 2018; Harrington et al., 2018). Плазмиды, которые были заказаны у Addgene, несут ген устойчивости к ампициллину и позволяют конститутивно продуцировать ингибитор транскрипции LacI. Экспрессия интересующего гена находится под контролем промотора полимеразы Т7 (уже экспрессируемого штаммом Rosetta) и оператора lacO. Трансформированные бактерии выращивали в течение ночи в LB с добавлением ампициллина (200 мг / мл), хлорамфеникола (30 мг / мл) и глюкозы (0,2%). Клетки разводили в 1 л Terrific Broth (богатая среда) с добавлением антибиотиков до OD600 = 0,1 и выращивали при 37 ° C до достижения OD 0,5. Затем добавляли IPTG (0,5 мМ) и культуру встряхивали при 18 ° C в течение 16 часов для продукции белка. Бактерии собирали центрифугированием при 5000g в течение 15 мин и ресуспендировали в 40 мл буфера LEW (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 8,0), содержащего коктейль полного ингибитора протеазы (Roche). После лизиса ультразвуком белки, несущие His-метки, очищали с использованием никелевых колонок (Protino Ni-IDA 1000, Machery-Nagel) и расщепляли с помощью SenP2 (Cas13a) или протеазы TEV (Cas14a1) для удаления гистидиновых меток и доменов солюбилизации. они несли. Затем Cas13a очищали с помощью FPLC на колонке с гепарином (1 мл, GE Healthcare), используя градиент с использованием раствора A (50 мМ NaH2PO4, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ бета-меркаптоэтанол (BME)) и раствора B (50 мМ NaH2PO4, pH 7,5, 1 M NaCl, 10% глицерин, 1 мМ BME). Для очистки Cas14a1 гепарином раствор B представлял собой 50 мМ NaH2PO4 pH 7,5, 1,5 М NaCl, 10% глицерин, 1 мМ BME. Затем белки разбавляли в 3 раза 50 мМ NaH2PO4 pH 7,5, 20 мМ NaCl, 10% глицерином, 1 мМ BME. Наконец, для концентрирования белка использовали центробежное устройство Millipore. Белки хранили при -20 ° C после добавления глицерина до 50%. Белки анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси.
Cas13a and Cas14a1 detection assays All the measurements were made on 96 wells fluorescent assay plates. We first denatured our oligos at 65°C (cooling down at -2°C/min until reaching room temperature), and then incubated at 37°C, Cas13 and Cas14 with their corresponding cr/sgRNA, respectively : crRNA 125, 3613 or 7863 for Cas13 and sgRNA for Cas14. Each Cas complex was then incubated with its activator (miRNA for a Cas13 only assay or ssDNA activator for a Cas14 only assay, and activated Cas13 complex + cleaved ST-HP for a full cascade test). Incubation times of 10 minutes, 30 minutes, 1 hour and 2 hours were tested for each step to optimize the reactions.
FIGURE 2 : Cas13a-only reaction Detailed process of the reaction used to test Cas13a independently from the rest of the system. We first denatured both the crRNA (from 5 to 100 nM) and the miRNA (from 0.2 to 200 nM) of our chosen couple, we then incubated the denatured crRNA with the Cas13 (20 nM) protein and incubated the now bound Cas13a/crRNA complex with the miRNA for annealing. Once this step is over we mixed the solution with a buffer and the RNA probe (200 nM) on a fluorescence assay plate. This reaction was used first to assess whether or not Cas13a alone was efficient for miRNA detection. And once the enzymatic activity was confirmed we used it with both crRNA (Fig 5-8) and miRNA (Fig 9-10) concentration gradients to find their optimal concentration for the cascade reaction. All three mi/crRNA couples were tested with the crRNA concentration gradient while only the mi/crRNA-125b couple was tested with the miRNA gradient. We also tested the Cas13 only reaction in a heterogeneous medium composed of Hela cell total RNA acquired from I2BC lab (50 to 600 nM) , we did the same with bacterial total RNA extracted from a Rosetta strain culture done previously (50 to 600 nM), using it as specificity control.
FIGURE 3 : Cas14a1-only reaction Detailed process of the reaction used to test Cas14a1 independently from the rest of the system. We first denatured the sgRNA and once denatured we incubated it with Cas14 (30 nM). Once bound we incubated the Cas14a1/sgRNA complex with an ssDNA activator (6 to 120 nM) for annealing. After both these steps were completed we mixed the complexe with the ssDNA probe (500 nM) on the fluorescence assay plate. This reaction was used to assess whether or not Cas14a1 alone was efficient. We tested it with varying concentrations of sgRNA but constant concentrations of other elements (Fig 11).
FIGURE 4 : Cascade reaction Detailed process of the final cascade reaction. We first denatured all three previously used elements, sgRNA and our crRNA/miRNA couple of choice. We then incubated Cas14a1 (30 nM) with the sgRNA (12 or 30 nM) and Cas13 (20 nM) with the crRNA (20 nM), afterward we incubated the Cas13/crRNA complex with the miRNA. We incubated once again now activated Cas13 (Cas13 + crRNA + miRNA) with ST-HP (200 nM). Afterward we incubated the activated Cas13 and the cleaved ST-HP with the inactive Cas14/sgRNA complex, ST-HP’s now exposed single strand would now anneal with the Cas14/sgRNA complex which would result in an active Cas14. Once all those steps are completed we mixed everything with the ssDNA probe (100, 200 or 500 nM) on a fluorescence assay plate.FIGURE 5 : All used reactions recap.
Tests de détection par Cas13a et Cas14a1 Toutes les mesures ont été effectuées en plaques d’essais fluorescents 96 puits. Nous avons d'abord dénaturé nos oligos à 65°C (refroidissement à -2°C/min jusqu'à atteindre la température ambiante), puis nous avons incubé à 37°C, Cas13 et Cas14 avec leurs cr/sgRNA correspondants, respectivement : crRNA 125, 3613 ou 7863 pour Cas1a3 et sgRNA pour Cas14a1. Chaque complexe Cas a ensuite été incubé avec son activateur (miRNA pour un test Cas13 seule, activateur ssDNA pour un test Cas14 seule, et complexe Cas13 activé + ST-HP clivé pour un test en cascade complet). Des temps d'incubation de 10 minutes, 30 minutes, 1 heure et 2 heures ont été testés pour chaque étape afin d'optimiser les réactions.
FIGURE 2 : Réaction avec Cas13a seule Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester Cas13a indépendamment du reste du système. Nous avons d'abord dénaturé le crRNA (5 à 100 nM) et le miRNA (0,2 à 200 nM) de notre couple choisi, puis nous avons incubé le crRNA dénaturé avec la protéine Cas13a (20 nM). Nous avons ensuite incubé le complexe Cas13/crRNA nouvellement formé avec le miRNA pour l'hybridation. Une fois cette étape terminée, nous avons mélangé la solution avec un tampon et la sonde ARN (200 nM) sur une plaque d'essai de fluorescence. Cette réaction a d'abord été utilisée pour évaluer si Cas13a était efficace pour la détection des miRNAs, et une fois l'activité enzymatique confirmée, nous l'avons utilisée avec des gradients de concentration de crRNA (Fig 5-8) et de miRNA (Fig 9-10) pour trouver leurs concentration optimale pour la réaction en cascade. Les trois couples mi/crRNA ont été testés avec le gradient de concentration crRNA tandis que seul le couple mi/crRNA-125b a été testé avec le gradient miRNA. Nous avons également testé la réaction de Cas13a seule dans un milieu hétérogène composé d'ARN total de cellules Hela acquis auprès du laboratoire I2BC (50 à 600 nM), nous avons fait de même avec de l'ARN total bactérien extrait d'une culture de la souche Rosetta réalisée précédemment (50 à 600 nM), utilisant ainsi ces deux tests comme contrôles de spécificité.
FIGURE 3 : Réaction avec Cas14a1 seule Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester Cas14a1 indépendamment du reste du système. Nous avons d'abord dénaturé le sgRNA et une fois dénaturé nous l'avons incubé avec Cas14a1 (30 nM). Une fois lié nous avons incubé le complexe Cas14/sgRNA avec un activateur ssDNA (6 à 120 nM) pour hybridation. Après que ces deux étapes aient été terminées, nous avons mélangé le complexe avec la sonde d'ADNsb (500 nM) sur la plaque d'essai de fluorescence. Cette réaction a été utilisée pour évaluer si Cas14a1 seule était efficace ou non. Nous l'avons testée avec des concentrations variables de sgRNA mais des concentrations constantes des autres éléments (Fig 11).
FIGURE 4 : Réaction en Cascade Processus détaillé de la réaction utilisée pour tester la réaction en cascade. Nous avons d'abord dénaturé les trois éléments précédemment utilisés, le sgRNA et le couple crRNA/miRNA de notre choix. Nous avons ensuite incubé Cas14a1 (30 nM) avec le sgRNA (12 ou 30 nM) et Cas13a (20 nM) avec le sgRNA (20 nM), puis nous avons incubé le complexe Cas13a/crRNA avec le miRNA. Nous avons incubé une fois de plus Cas13a maintenant activée (Cas13a + crRNA + miRNA) avec la ST-HP (200 nM). Ensuite, nous avons incubé la Cas13a activée et la ST-HP clivée avec le complexe Cas14a1/sgRNA inactif. Le simple brin exposé de la ST-HP va maintenant s'hybrider avec le complexe Cas14a1/sgRNA, ce qui donnera une Cas14 active. Une fois toutes ces étapes terminées, nous avons mélangé le tout avec la sonde ADNsb (100, 200 ou 500 nM) sur une plaque d'essai de fluorescence.
FIGURE 5 : Récapitulation de toutes les réactions utilisées.
Анализы для обнаружения Cas13a и Cas14a1 Все измерения проводились на 96-луночных планшетах для флуоресцентного анализа. Сначала мы денатурировали наши олигонуклеотиды при 65 ° C (охлаждение со скоростью -2 ° C / мин до достижения комнатной температуры), а затем инкубировали при 37 ° C, Cas13 и Cas14 с их соответствующими cr / sgRNA, соответственно: crRNA 125, 3613 или 7863 для Cas13 и sgRNA для Cas14. Затем каждый комплекс Cas инкубировали с его активатором (miRNA для анализа только Cas13 или активатор ssDNA для анализа только Cas14 и активированный комплекс Cas13 + расщепленный ST-HP для полного каскадного теста). Время инкубации составляло 10 минут, 30 минут, 1 час и 2 часа для каждого шага, чтобы оптимизировать реакции.
РИСУНОК 2: Реакция только Cas13a Подробный процесс реакции использовался для тестирования Cas13a независимо от остальной системы. Сначала мы денатурировали как crRNA (от 5 до 100 нМ), так и miRNA (от 0,2 до 200 нМ) выбранной нами пары, затем мы инкубировали денатурированную crRNA с белком Cas13 (20 нМ) и инкубировали теперь связанный комплекс Cas13a / crRNA с miRNA для отжига. По завершении этого этапа мы смешали раствор с буфером и зондом РНК (200 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа. Эта реакция была использована сначала, чтобы оценить, эффективен ли только Cas13a для обнаружения miRNA. И как только ферментативная активность была подтверждена, мы использовали ее с градиентами концентрации как crRNA (рис. 5-8), так и miRNA (рис. 9-10), чтобы найти их оптимальную концентрацию для каскадной реакции. Все три пары mi / crRNA тестировали с градиентом концентрации crRNA, тогда как только пару mi / crRNA-125b тестировали с градиентом miRNA. Мы также протестировали реакцию только Cas13 в гетерогенной среде, состоящей из общей РНК клеток Hela, полученной из лаборатории I2BC (от 50 до 600 нМ), мы сделали то же самое с общей РНК бактерий, экстрагированной из культуры штамма Rosetta, сделанной ранее (от 50 до 600 нМ). , используя его как контроль специфичности.
РИСУНОК 3: Реакция только Cas14a1 Подробный процесс реакции, используемый для тестирования Cas14a1, независимо от остальной системы. Сначала мы денатурировали sgRNA, а после денатурирования инкубировали ее с Cas14a1 (30 нМ). После связывания мы инкубировали комплекс Cas14 / sgRNA с активатором ssDNA (от 6 до 120 нМ) для гибридизации. После завершения этих двух этапов мы смешали комплекс с зондом оцДНК (500 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа. Эту реакцию использовали для оценки эффективности только Cas14a1. Мы протестировали его с различными концентрациями sgRNA, но постоянными концентрациями других элементов (рис. 11).
РИСУНОК 4: Каскадная реакция Подробный процесс финальной каскадной реакции. Сначала мы денатурировали три использованных ранее элемента, sgRNA и пару crRNA / miRNA по нашему выбору. Затем мы инкубировали Cas14a1 (30 нМ) с sgRNA (12 или 30 нМ) и Cas13a (20 нМ) с sgRNA (20 нМ). Затем мы инкубировали комплекс Cas13a / crRNA с miRNA. Мы снова инкубировали активированный Cas13a (Cas13a + crRNA + miRNA) с ST-HP (200 нМ), после инкубировали активированный Cas13a и расщепленный ST-HP с неактивным комплексом Cas14a1 / sgRNA. Обнаруженная одиночная цепь шпильки ST-HP теперь будет гибридизоваться с комплексом Cas14a1 / sgRNA, в результате чего образуется активный Cas14. После того, как все эти шаги были выполнены, мы смешали все с зондом оцДНК (100, 200 или 500 нМ) на планшете для флуоресцентного анализа.РИСУНОК 5: Сводка всех использованных реакций.
