Team:GO Paris-Saclay/Proof Of Concept

Proof of concept

Preuve du concept

Подтверждение модели

At lab
Our project consisted in detecting miRNAs in a specific way at a concentration down to nM or even lower thanks to a cascade of reactions involving the Cas13a and Cas14a1 proteins. Cas13a playing the role of detector and Cas14a1 the role of signal amplifier.

If the part of the cascade involving Cas14a1 does not seem to have worked as desired, this one seems to present a basal activity generating a background noise without presenting a really increased activity once activated; Cas13a1 seems to fulfill efficiently its role of detector. Indeed, out of the three miRNAs tested, two of them seem to be efficiently detected (Figure 1).


Figure 1 : Cas13a activity pre-incubated with crRNA-125b-5p and incubated with different concentrations of miR-125p-5b.

Furthermore, the specificity of detection by Cas13a was also demonstrated by incubating Cas13a preincubated with crRNA directed against miR-125p-5b with total RNAs from bacteria, human cells, or with miR-3613-5p miRNA. Under these conditions, no detection was measured (Figure 2).


Figure 2: Cas13a with cr/miR-125b-5p activity incubated with different total bacterial RNA (A), total human RNA (B), or miR-3613-5p concentrations (A-B).

Thus, although amplification with Cas14a1 would probably allow detection at lower miRNA concentrations. Our team has succeeded in developing a functional miRNA detection reaction allowing detection at concentrations of the order of 20nM.

Au laboratoire
Notre projet consistait à détecter des miRNAs de manière spécifique à une concentration pouvant aller jusqu’au nM voir encore plus bas grâce à une cascade de réactions faisant intervenir les protéines Cas13a et Cas14a1. Cas13a jouant le rôle de détecteur et Cas14a1 celui d’amplificateur du signal.

Si la partie de la cascade faisant intervenir Cas14a1 ne semble pas avoir fonctionné comme souhaité, celle-ci semblant présenter une activité basale engendrant un bruit de fond sans pour autant présenter une activité véritablement accrue une fois activée; Cas13a1 semble remplir efficacement son rôle de détection. En effet, sur les trois miRNAs testés, deux d’entres eux semblent être détectés efficacement (Figure 1).


Figure 1 : Activité de Cas13a pré-incubée avec crRNA-125b-5p et incubée avec miR-125p-5b à différentes concentrations.

Par ailleurs, la spécificité de la détection par Cas13a a également été démontrée par l’incubation de Cas13a préincubée avec le crRNA dirigé contre miR-125p-5b avec des ARNs totaux de bactéries, de cellules humaines, ou avec le miRNA miR-3613-5p. Dans ces conditions, aucune détection n’a été mesurée (figure 2).


Figure 2: Activité de Cas13a avec cr/miR-125b-5p incubée différentes concentrations d’ARNs totaux de bactéries (A),de cellules humaines (B), ou de miR-3613-5p (A-B).

Par ailleurs, la spécificité de la détection par Cas13a a également été démontrée par l’incubation de Cas13a préincubée avec le crRNA dirigé contre miR-125p-5b avec des ARNs totaux de bactéries, de cellules humaines, ou avec le miRNA miR-3613-5p. Dans ces conditions, aucune détection n’a été mesurée (figure 2).

Лаборатория
Наш проект заключался в обнаружении миРНК особым образом при концентрации до нМ или даже ниже благодаря каскаду реакций с участием белков Cas13a и Cas14a1. Cas13a играет роль детектора, а Cas14a1 - усилителя сигнала.

Если часть каскада, включающая Cas14a1, кажется, не сработала должным образом, этот каскад, по-видимому, представляет базальную активность, генерирующую фоновый шум, но не проявляет действительно повышенной активности после активации; Cas13a1, кажется, эффективно выполняет свою роль детектора. Действительно, из трех протестированных miRNA две из них, по-видимому, эффективно обнаруживаются (Рисунок 1).


Рисунок 1: Активность Cas13a, предварительно инкубированная с crRNA-125b-5p и инкубированная с различными концентрациями miR-125p-5b.

Кроме того, специфичность обнаружения с помощью Cas13a также была продемонстрирована путем инкубирования Cas13a, предварительно инкубированного с crRNA, направленной против miR-125p-5b, с общими РНК из бактерий, клеток человека или с miRNA miR-3613-5p. В этих условиях обнаружение не производилось (рис. 2).


Рисунок 2: Cas13a с активностью cr / miR-125b-5p, инкубированный с различными концентрациями общей бактериальной РНК (A), общей РНК человека (B) или miR-3613-5p (A-B).

Таким образом, хотя амплификация с помощью Cas14a1, вероятно, позволит детектировать при более низких концентрациях miRNA. Нашей команде удалось разработать функциональную реакцию обнаружения миРНК, позволяющую обнаруживать их при концентрациях порядка 20 нМ.