1. 靶向ACE2的CRISPR-Cas13系统设计
通过生物信息学筛选针对 ACE2 保守序列的 crRNA 池,设计 sgRNA 序列,将其嵌入 pLentiRNACRISPR_005 - hU6-DR_BsmBI-EFS-RfxCas13d-NLS-2A-Puro-WPRE 质粒中相应位置并合成质粒。
Fig.5.SgRNA Schematic Diagram
2. 体外验证RfxCas13d和gRNA靶向功能
将编码 RfxCas13d 基因克隆到 pET-28a 载体上,将所得质粒转入 Rosetta 中,构建 RfxCas13d 重组表达菌株,使用镍柱纯化 RfxCas13dd 蛋白,并通过 SDS-PAGE 和 Western blot 验证 RfxCas13d 的表达。使用 T7 高效体外转录试剂盒,用 RNA 纯化试剂盒纯化 RNA,通过金唯智公司合成设计好的靶向 ACE2 转录本的 sgRNA。利用 SHERLOCK 方法在 RT-PCR 仪中验证 Cas13d 系统靶向切割 ACE2 转录本的效果。
Fig.6.In Vitro Verification of RfxCas13d and gRNA Targeting Functions Process diagram
3. 新冠假病毒的制备
培养 HEK293T 细胞,将 PMD2.G,psPAX2 及 pLenti CMV GFP Puro 三质粒共转染HEK293T 细胞作为阳性对照,pCMV14-3X-FLAG-SARS-CoV-2 S,psPAX2 及 pLenti CMV GFP Puro质粒共转染作为实验组,收集假病毒上清。
Fig.7. PMD2.G,psPAX2 and pLenti CMV GFP Puro Three Plasmid System
Fig.8.pCMV14-3X-FLAG-SARS-CoV-2 S,psPAX2 and pLenti CMV GFP Puro Three Plasmid System
4. hACE2稳转细胞系的构建
培养 HEK293T 细胞,将 PMD2.G,psPAX2 及 pLENTI-hACE2-T2A-mRFP-PURO-PSB1A3三质粒共转染 HEK293T 细胞,收集假病毒上清。感染HEK293T细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选、单克隆扩大培养及RT-PCR验证ACE2表达水平。
Fig.9.PMD2. G, psPAX2 and pLENTI-hACE2 - T2A-mRFP-PURO-PSB1A3 Three Plasmid System
5. 细胞学验证CCRISPR-Cas13d系统对于新冠病毒侵染的抑制效果
制备慢病毒/CRISPR-Cas13d系统用于感染细胞,培养稳定表达Cas13d的细胞系并进行培养,并用 SARS-CoV-2 假病毒攻击稳定表达Cas13d的细胞。转染一定时间后使用流式细胞仪和RT-PCR的方法检测细胞中SARS-CoV-2的表达情况。
Fig.10.Flow Chart Experimental Design